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【闖關(guān)贏好禮】流式高手挑戰(zhàn)賽第一期：樣本制備不踩坑！
你是實(shí)驗(yàn)室里的“流式王者”嗎？
「流式高手挑戰(zhàn)賽」火力全開(kāi)！
3期連炸，每?jī)芍芙怄i一個(gè)必學(xué)主題
樣本制備、細(xì)胞分選、配色避坑
直擊實(shí)驗(yàn)痛點(diǎn)！
每期奉上：
1篇硬核干貨（快速掌握關(guān)鍵技巧）
答題沖榜（答案就藏在文章里）
大獎(jiǎng)等你贏：隨行杯、鼠標(biāo)等驚喜周邊，快來(lái)挑戰(zhàn)吧！
本期主題：樣本制備
（具體玩法與規(guī)則，請(qǐng)滑至文末查看）
流式細(xì)胞技術(shù)可以追蹤細(xì)胞“從外到內(nèi)”所有分子事件，是科研人員不可或缺的利器。制備出高質(zhì)量的分散單細(xì)胞，不僅是流式實(shí)驗(yàn)的第一步，也是實(shí)現(xiàn)分析結(jié)果規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵。接下來(lái)，我們將為大家梳理各種樣本的制備流程與注意事項(xiàng)，助您實(shí)驗(yàn)事半功倍！
一、細(xì)胞系樣本
01 懸浮細(xì)胞
直接洗滌即可，不需消化。
02 貼壁細(xì)胞
需胰酶/EDTA消化。做凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)需要用binding buffer wash 1-2遍，洗去殘留EDTA。做分選時(shí)，單細(xì)胞懸液需加入DNase防止聚團(tuán)。
二、外周血、骨髓樣本制備
01 樣本采集與保存
使用EDTA或肝素抗凝，12h內(nèi)檢測(cè)可室溫保存，24-48h處理需4℃保存。
02 紅細(xì)胞裂解
取100-200μl抗凝全血/骨髓，加入2ml紅細(xì)胞裂解液，輕柔混勻，外周血室溫孵育裂解10min，骨髓裂解5-8min；特殊樣本可增加稀釋度或延長(zhǎng)裂解時(shí)間，加入PBS至滿管，300-400g離心5min，棄上清以終止裂解；重復(fù)PBS離心洗滌，去除碎片。
骨髓樣本粘稠需用PBS稀釋后再裂解；若紅細(xì)胞殘留，可重復(fù)裂解1次。推薦使用商品化裂解液，不同品牌以具體說(shuō)明書為準(zhǔn)。
如何判斷紅細(xì)胞裂解是否完成？
在燈光下觀察，若樣本已呈現(xiàn)透亮狀態(tài)，說(shuō)明基本裂解完成。若采用“先裂后染”的流程，建議在透亮后再額外放置約5分鐘，以確保裂解更徹底。
03 抗體染色
胞膜表面染色：根據(jù)Panel用量加入5-20μl不同熒光素標(biāo)記的抗體，避光室溫孵育15min，PBS離心洗滌后，重懸于PBS中，若不及時(shí)檢測(cè)，可加多聚甲醛固定后避光4℃保存，待上機(jī)檢測(cè)。
胞內(nèi)染色：按照不同廠家的說(shuō)明書，先標(biāo)記膜表面抗體，再添加破膜劑處理10min，后加入胞內(nèi)抗體，避光室溫孵育30min，洗滌后重懸。
04 注意事項(xiàng)：
熒光染色過(guò)程可以有不同的流程順序：染色-裂解-洗滌，染色-裂解-免洗，裂解-染色-洗滌。不同的染色流程對(duì)流式樣本的熒光強(qiáng)度有明顯影響，根據(jù)多中心數(shù)據(jù)表明，染色后裂解繼而洗滌，可以改善FSC、SSC的CV，得到最高的熒光強(qiáng)度。
三、組織樣本制備
01 樣本采集
新鮮組織樣本置于生理鹽水或PBS中，室溫保存，盡量在12h內(nèi)處理樣本；若無(wú)法及時(shí)處理，4℃保存，保存時(shí)間最好不要超過(guò)48h。
02 常用方法
剪碎研磨：眼科剪將組織剪成極小塊后注射器針芯研磨成勻漿，PBS混勻后，200-300目濾網(wǎng)過(guò)濾，離心去上清，PBS洗滌后調(diào)整至所需濃度備用。
網(wǎng)搓：剪碎的組織在300目尼龍網(wǎng)上，邊搓邊PBS沖洗，收集懸液，離心去上清，PBS洗滌后調(diào)整至所需濃度備用。
研磨：組織剪成小塊放入組織研磨器加PBS研磨至勻漿，加PBS沖洗后收集懸液再過(guò)200-300目尼龍網(wǎng)，離心沉淀去上清，PBS洗滌后調(diào)整至所需濃度備用。
蛋白酶消化：組織塊用PBS漂洗后剪成小塊，加入蛋白酶溶液，轉(zhuǎn)至三角燒瓶于37℃水浴或者恒溫箱中消化一定時(shí)間，每隔5-10min震蕩，直至完成消化。消化液經(jīng)200-300目濾網(wǎng)過(guò)濾后離心5min，去上清，PBS洗滌后調(diào)整至所需濃度備用。
03 注意事項(xiàng)
不同組織樣本根據(jù)不同檢測(cè)項(xiàng)目要求需選用不同的處理方法。酶處理注意時(shí)間、pH值、濃度等影響，且根據(jù)組織類型選擇合適的酶。
04 特殊樣本
上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞：截取回腸，使用HBSS+FBS+EDTA+DTT+Hepes沖洗，搖床10–15min。
固有層淋巴細(xì)胞：使用5% FBS+1.5mg/ml Collagenase VIII+0.1mg/ml DNase in PBS消化30-60min，研磨后用Percoll 40/80%分離。
毛囊干細(xì)胞：剃毛取背皮→去脂肪→胰酶消化4℃過(guò)夜→37℃ 1h→刮下表皮，過(guò)濾。
臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞：
1. 物理法：剖開(kāi)臍帶，抽掉動(dòng)脈和靜脈，剪成小段，貼壁培養(yǎng)。
2. 消化法：剪碎+膠原酶/透明質(zhì)酸酶/胰酶/DNase，離心去上清。
四、抗體染色與檢測(cè)注意事項(xiàng)
離心：必須用平轉(zhuǎn)子離心機(jī)，防止細(xì)胞損傷。
核內(nèi)vs胞內(nèi)染色：根據(jù)需求選擇透膜劑。
特殊檢測(cè)（如pSTAT5等磷酸化蛋白）：可能需混搭固定破膜劑。
抗體用量與細(xì)胞數(shù)關(guān)系不大，主要取決于反應(yīng)體積。
隨著技術(shù)發(fā)展，目前已經(jīng)有自動(dòng)化樣本處理儀如貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué)CellMek SPS應(yīng)用于臨床，這類儀器的使用會(huì)大大提高檢測(cè)效率和分析精密度。各位感興趣的小伙伴如需了解更多詳細(xì)信息，歡迎聯(lián)系貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué)技術(shù)支持和業(yè)務(wù)代表獲取詳細(xì)資料。
三期連載 流式高手挑戰(zhàn)賽·贏大獎(jiǎng)！
01 參與方式
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不限時(shí)答題：10道單選題，分?jǐn)?shù)相同，用時(shí)更短者獲勝。
02 活動(dòng)獎(jiǎng)勵(lì)
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每期TOP1：贏定制版積木。
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每期TOP2–9：鼠標(biāo)、隨行杯、折疊太陽(yáng)傘隨機(jī)送出。
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全員福利：每期參與即有機(jī)會(huì)抽取蛇年限定公仔20只。
掃描二維碼，闖關(guān)贏好禮
03 活動(dòng)說(shuō)明
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同一ID或姓名在每期僅可獲獎(jiǎng)一次；如重復(fù)獲獎(jiǎng)，按最高獎(jiǎng)項(xiàng)發(fā)放，其余獎(jiǎng)品順延。
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活動(dòng)結(jié)束后15個(gè)工作日內(nèi)聯(lián)系獲獎(jiǎng)?wù)撸?qǐng)確保個(gè)人信息準(zhǔn)確完整。收件地址須為單位地址。
下一期將于9月上線
高手們，記得準(zhǔn)時(shí)來(lái)戰(zhàn)！
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